53BP1p53结合蛋白1是DNA双链断裂损伤应答通路中的关键早期响应因子在维持基因组稳定性、调控修复途径选择及肿瘤抑制中发挥核心作用。针对53BP1的高特异性抗体是研究DNA损伤修复、细胞周期检查点以及肿瘤发生机制的重要工具。本文详细介绍由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源抗53BP1亲和纯化多克隆抗体货号A300-273A的技术参数、生产工艺、Western blot应用条件及实验要点为用户提供系统的操作参考。一、产品基本规格该抗体为兔多克隆抗体靶向人53BP1蛋白由TP53BP1基因编码GeneID 7158同时与小鼠53BP1具有交叉反应性。抗体形式为完整IgG未偶联标记物亚型为IgG。采用特异性表位亲和纯化工艺获得。抗体浓度为1000 µg/ml1 mg/ml保存于Tris-柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液pH 7–8中含0.09%叠氮钠作为防腐剂。储存条件为2–8°C自收货之日起有效期为一年。注意事项缓冲液中含叠氮钠可抑制过氧化物酶活性。对于常规Western blot检测一抗稀释至工作浓度后如1:2,000–1:10,000叠氮钠浓度极低0.000045%对HRP二抗活性影响可忽略。若进行超高灵敏度化学发光检测可通过透析或超滤去除叠氮钠。叠氮钠具毒性操作时需戴手套并妥善处置废液。二、免疫原与表位信息抗体采用特异性表位亲和纯化工艺。免疫原对应人53BP1蛋白第1925位氨基酸至C末端C端截止于第1972位氨基酸之间的区域参考序列号NP_005648.1GeneID 7158。该表位位于53BP1的C端结构域该区域包含与p53相互作用及DNA损伤应答相关的关键功能基序。亲和纯化时将上述表位肽段固定于固相载体从抗血清中捕获特异性IgG确保抗体仅识别53BP1蛋白而不与非相关蛋白发生交叉反应。免疫球蛋白浓度依据比尔定律测定1 mg/ml IgG在280 nm处吸光度为1.4。三、推荐的应用与实验条件根据产品规格该抗体主要验证用于Western blotWB。未提供IHC或IP的验证稀释度用户如需拓展应用需自行优化。Western BlotWB推荐稀释度1:2,000 – 1:10,000凝胶建议推荐使用3–8% Tris-乙酸酯凝胶。53BP1分子量较大约210–220 kDa低百分比凝胶或梯度凝胶可获得更好的分离效果。常规Tris-甘氨酸体系也可使用但建议采用4–12%梯度凝胶或6–8%固定浓度凝胶。封闭与稀释使用5%脱脂牛奶-TBST作为封闭液和抗体稀释液。一抗孵育条件为过夜建议4°C缓慢摇动以提高特异性结合。二抗使用山羊抗兔IgG重链轻链二抗推荐货号A120-101P。HRP标记二抗后采用ECL化学发光法检测。样品制备建议提取全细胞裂解液时推荐使用含蛋白酶抑制剂PMSF、cocktail和磷酸酶抑制剂如Na3VO4、NaF的RIPA缓冲液或NP-40裂解液。由于53BP1是核蛋白制备核提取物可显著富集目标蛋白。上样前建议进行蛋白定量每孔上样30–50 µg总蛋白。煮沸变性时间建议5–10分钟53BP1分子量大且可能形成聚集充分变性有助于改善电泳效果。四、靶点生物学背景53BP1也称p53结合蛋白1、TDRD30最初被鉴定为p53的相互作用蛋白。后续研究发现它是DNA双链断裂DSB损伤应答中的核心调控因子。在DNA损伤发生后53BP1通过其Tudor结构域识别组蛋白H4K20me2和H2AK15ub等表观标记迅速被招募至损伤位点形成核灶foci。53BP1在修复途径选择中发挥关键作用促进非同源末端连接NHEJ而抑制同源重组HR。它与Brca1形成拮抗关系共同调控DSB修复方式的决策。在G1期53BP1促进NHEJ在S/G2期被Brca1拮抗以允许HR进行。此外53BP1还参与Chk2等检查点激酶的磷酸化激活介导细胞周期阻滞。53BP1的功能异常与肿瘤发生、免疫缺陷及衰老密切相关。在BRCA1突变的乳腺癌中53BP1缺失可恢复部分同源重组功能并导致治疗抵抗。因此该抗体适用于DNA损伤应答、肿瘤生物学及药物筛选等领域的研究。五、产品性能特点1. 精确定位的表位靶向53BP1 C端第1925–1972位氨基酸该区域在多个物种中相对保守支持人/小鼠交叉反应性。明确的表位区域便于用户结合突变体或截短体实验进行验证。2. 亲和纯化抗原亲和纯化显著降低非特异性背景在Western blot中呈现清晰的单一条带或少量特异条带。3. 高稀释比WB稀释度最高达1:10,000抗体使用经济适合高通量筛选或珍贵样本分析。4. 人/小鼠交叉反应经验证与小鼠53BP1反应适用于鼠源细胞系或组织样本拓展了应用范围。5. 大分子量兼容性产品明确推荐使用3–8% Tris-乙酸酯凝胶说明针对大分子量蛋白~220 kDa进行了优化确保转膜效率和检测灵敏度。6. 稳定性2–8°C储存一年无需冷冻避免反复冻融导致的效价下降。