流程类器官原代培养流程准备工作仪器设备CO2培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅或水浴摇床医用冰箱、-80℃冰箱、移液器一套、眼科剪刀、眼科镊。类器官原代一、使用前准备A.组织消化液准备使用前将皮肤组织消化液Ⅰ从-20℃环境取出放置室温使其融化待完全溶解后上下颠倒瓶身数次使液体充分混匀皮肤组织消化液Ⅰ加入12.5mL类器官原代培养缓冲液配置后在标签上记录配制日期于2-8℃冰箱避光保存注皮肤组织消化液Ⅰ配制完成后建议在1个月内使用完。B.配置含有5%FBS、1%青霉素-链霉素的类器官原代培养缓冲液作为中和液用于终止消化注本实验所用离心管、枪头等需提前使用PBS-BSA润洗液进行润洗。二、原代组织消化1、将手术样本环形包皮组织展平于10cm培养皿中用含有1%青霉素-链霉素的类器官原代培养缓冲液浸泡反复漂洗去除残留血液2、剔除组织的皮下结构如脂肪、血管等漂洗数次3、将组织均匀剪成0.5-1.5cm左右大小方块状再次漂洗直至漂洗液清澈4、将清洗后小块组织放入10mL新鲜配置的皮肤组织消化液Ⅰ中表皮层朝下置于4℃冰箱中过夜消化注建议消化时间为12-14h5、消化过夜后用无菌镊子轻轻牵拉将包皮组织的表皮和真皮分离收集表皮皮片6、用无菌眼科剪将表皮剪碎成糊状置入培养皿中7、加入3mL皮肤组织消化液Ⅱ于37℃的培养箱中消化10min8、将培养皿置于显微镜下观察消化情况注可轻拍皿壁镜下见大量漂浮游离的细胞亮点即证明消化过程完毕否则可适当延长消化时间。9、消化完成后加入3mL含有5%FBS、1%青霉素-链霉素的类器官原代培养缓冲液终止消化10、反复轻柔吹打使细胞团块分散11、40μm细胞筛网过滤过滤液收集至50mL离心管中12、4℃300 x g离心5min13、使用类器官原代培养缓冲液重悬细胞沉淀14、4℃300 x g离心5min15、离心后弃去上清保留底部细胞沉淀16、按照4-0.6x10^6/mL的密度加入适量的基质胶并吹打混匀10-15次。注此步骤速度要尽可能快避免基质胶温度升高而凝固吹打时注意不要产生气泡17、按照50μL/孔的量将基质胶与类器官悬液滴加至24孔板中心成半球形状注种板时操作确保迅速避免基质胶温度升高而凝固18、将培养板置于37℃恒温培养箱中20min放置过程中避免晃动培养板19、取出培养板每孔加入完全培养基500μL20、显微镜下观察类器官种板情况培养板放入37℃细胞培养箱中继续培养。类器官传代一、使用前准备A.类器官完全培养基和传代消化液分装1、使用前按照每次用量分别分装完全培养基和类器官消化液2、在配制好的完全培养基和标签上记录配制日期于2℃-8℃冰箱避光保存3、在配制好的消化液标签上记录配制日期于-20℃冰箱避光保存注建议完全培养基在1-3个月内使用完B.基质胶使用前将基质胶置于冰上或2℃-8℃冰箱2-3h解冻注使用过程中保持基质胶在4℃以下建议置于冰上保存温度升高会致基质胶凝固而不可使用。C.润洗类器官操作过程中所有离心管、枪头操作前均需润洗避免类器官贴壁丢失二、传代步骤类器官培养6-7天或者类器官直径大于100μm可进行传代培养传代前从培养箱内取出24孔板放置倒置显微镜下观察有无污染或异常。1、取50mL类器官传代培养缓冲液放于冰上预冷2、取出培养板在生物安全柜中沿孔边缘吸去旧培养基3、每孔加入500uL类器官传代培养缓冲液反复吹打使基质胶从板底脱落将类器官转移至15mL离心管用预冷类器官传代培养缓冲液定容至10mL4、使用1000μL枪头温和吹打混匀20-30次使类器官从基质胶中洗脱出来4℃放置40min或-20℃冷冻3-5min5、4℃400 x g离心5min6、离心结束弃上清及上层基质胶保留细胞沉淀向管内加入新的预冷类器官传代培养缓冲液6mL1000μL枪头温和吹打混匀20-30次7、4℃400 x g离心5min8、离心后弃去上清保留细胞沉淀向离心管中加入2mL类器官传代消化液用1000μL枪头温和吹打混匀室温消化3-7min期间用吹打混匀1-2次用预冷类器官传代培养缓冲液定容至6mL注消化并吹打结束后可取样镜下观察类器官消化情况以类器官消化成单个细胞为宜弃上清时操作要小心避免吸液时类器官丢失9、4℃400 x g离心5min10、离心后弃去上清保留底部细胞沉淀11、按照4-0.6x10^6/mL的密度加入适量的基质胶并吹打混匀10-15次。注此步骤速度要尽可能快避免基质胶温度升高而凝固吹打时注意不要产生气泡12、按照50μL/孔的量将基质胶与类器官悬液滴加至24孔板中心成半球形状注种板时操作确保迅速避免基质胶温度升高而凝固13、将培养板置于37℃恒温培养箱中20min放置过程中避免晃动培养板14、取出培养板每孔加入完全培养基500μL15、显微镜下观察类器官种板情况培养板放入37℃细胞培养箱中继续培养。类器官冻存一、使用前准备A.类器官冻存液和消化液分装1、使用前按照每次用量分别分装冻存液和类器官消化液2、分别在配制好的冻存液和消化液标签上记录配制日期于-20℃冰箱避光保存B.润洗类器官操作过程中所有离心管、枪头操作前均需润洗避免类器官贴壁丢失。二、冻存步骤类器官培养6-7天或者类器官直径大于50μm可进行类器官冻存冻存前从培养箱内取出24孔板放置倒置显微镜下观察有无污染异常。1、取50mL类器官传代培养缓冲液放于冰上预冷2、取出培养板在生物安全柜中沿孔边缘吸去旧培养基3、每孔加入500uL类器官传代培养缓冲液反复吹打使基质胶从板底脱落将类器官转移至15mL离心管用预冷类器官传代培养缓冲液定容至10mL4、使用1000μL枪头温和吹打混匀20-30次使类器官从基质胶中洗脱出来4℃放置40min或-20℃冷冻3-5min5、4℃400 x g离心5min6、离心结束弃上清及上层基质胶保留细胞沉淀向管内加入新的预冷类器官传代培养缓冲液5mL1000μL枪头温和吹打混匀20-30次7、4℃400 x g离心5min8、离心后弃去上清保留细胞沉淀向离心管中加入2mL类器官传代消化液用1000μL枪头温和吹打混匀室温消化3-7min期间用吹打混匀1-2次用预冷类器官传代培养缓冲液定容至6mL注消化并吹打结束后可取样镜下观察类器官消化情况以类器官消化成单个细胞为宜弃上清时操作要小心避免吸液时类器官丢失9、4℃400 x g离心5min10、离心后弃去上清保留底部细胞沉淀11、按照0.5x10^6cell/Vial用户可根据需求决定冻存密度向离心管中添加类器官冻存液12、充分混匀后将悬液分装至细胞冻存管(1mL/Vial)13、放至程序性降温盒并转移至-80℃冰箱次日将类器官转移至液氮罐长期保存。类器官复苏一、使用前准备A.完全培养基分装1、使用前按照每次用量分装完全培养基2、在配制好的完全培养基标签上记录配制日期于2℃-8℃冰箱避光保存注建议完全培养基在1-3个月内使用完B.基质胶使用前将基质胶置于冰上或2℃-8℃冰箱2-3h解冻注使用过程中保持基质胶在4℃以下建议置于冰上保存温度升高会致基质胶凝固而不可使用。C.润洗类器官操作过程中所有离心管、枪头操作前均需润洗避免类器官贴壁丢失。二、复苏步骤复苏操作从冻存管解冻至放入培养箱培养过程控制在30min内以确保足够的类器官存活。1、准备低温、低速离心机一台并将温度设定为4℃预冷2、加样枪头提前放置-20℃预冷于加样前取出24孔板提前放入37℃恒温培养箱预热3、基质胶提前放置冰上或4℃冰箱解冻4、15mL无菌离心管用PBS-BSA润洗液润洗后置于冰上预冷5、将完全培养基从冰箱中取出将温度平衡至室温6、将类器官从液氮存储管中取出迅速将冻存管放入37℃水浴快速晃动1-2min待冻存管内大部分冰块融化后取出注从液氮罐取出类器官时请严格按照实验室生物安全管理规定做好防冻伤防护措施7、将冻存管放置于冰上带入细胞间用酒精棉球对管壁进行消毒后在生物安全柜中将类器官悬液转移至预冷的15mL离心管内加入5mL类器官传代培养缓冲液使用润洗后的1000μL移液枪头轻轻吹打10次混匀8、4℃ 300 x g 离心5min离心后弃去上清保留沉淀注离心后仔细观察离心管底部有一白色薄层沉淀避免吸液时丢失类器官。9、向离心管中加入600μL预冷的基质胶轻轻混匀10-15次注此步骤速度要尽可能快避免基质胶温度升高而凝固吹打时注意不要产生气泡请根据细胞量适当调整密度10、按照50μL/孔的量将基质胶与类器官悬液滴加至24孔板中心成半球形状注种板时操作确保迅速避免基质胶温度升高而凝固11、将培养板置于37℃恒温培养箱中孵育40min放置过程中避免晃动培养板12、孵育完成后取出培养板每孔加入完全培养基500μL13、显微镜下观察类器官复苏情况培养板放入37℃细胞培养箱中继续培养14、类器官换液每2天更换一次新鲜培养基。注接种后每日观察整个操作应遵守无菌操作规程。