导读在临床微生物实验室中肉汤微量稀释法MIC法是定量测定抗菌药物最低抑菌浓度的标准方法而ATCC 29213正是金黄色葡萄球菌MIC法质控的核心标准菌株。与纸片法的ATCC 25923相比29213具有产β-内酰胺酶的特性在质控设计中承担着不同的角色。本文从MIC法操作实践出发系统介绍该菌株的特性与应用要点。菌株基本信息ATCC 29213同属Staphylococcus aureussubsp.aureus但在耐药特征上与ATCC 25923存在显著差异该菌株携带blaZ基因可产生β-内酰胺酶青霉素酶因此对青霉素表现为耐药但对苯唑西林仍然敏感mecA阴性。这一特性使其在β-内酰胺酶抑制剂复合药物的质控中具有不可替代的价值。| 项目 | 内容 ||------|------|| 学名 |Staphylococcus aureussubsp.aureus|| ATCC编号 | 29213 || 生物安全等级 | BSL-2 || 推荐培养基 | CAMHB阳离子调节MH肉汤 || 培养温度 | 35±2°C || 培养时间 | 16-20小时 || 关键耐药特征 | 产β-内酰胺酶blaZmecA阴性 |生物学特性与形态形态学上ATCC 29213与ATCC 25923无明显差异革兰阳性球菌葡萄串状排列在MHA上形成金黄色光滑菌落。两者的核心区别在于耐药机制。ATCC 29213产β-内酰胺酶可水解青霉素G和氨苄西林等窄谱青霉素类药物。需要注意的是β-内酰胺酶的产量可能随传代次数变化因此在质控操作中传代次数应严格控制在5代以内。笔者在日常工作中发现超过5代的工作菌种在头孢硝噻吩nitrocefin试验中可能出现弱阳性甚至阴性结果影响质控的准确性。该菌株不产PBP2amecA阴性对甲氧西林/苯唑西林敏感这一特性使其能够准确反映β-内酰胺类药物在非MRSA金黄色葡萄球菌中的MIC表现。培养条件与操作要点培养基选择MIC法使用的培养基是CAMHBCation-Adjusted Mueller-Hinton Broth即阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤。与普通MH肉汤的区别在于CAMHB的Ca²⁺和Mg²⁺浓度经过精确调节Ca²⁺: 20-25 mg/L, Mg²⁺: 10-12.5 mg/L这对氨基糖苷类和多粘菌素类药物的MIC测定尤为关键——阳离子浓度偏高会人为升高这些药物的MIC值。培养基的pH值应在校准后为7.3±0.125°C测定。笔者建议每批新到的CAMHB都做pH验证和阳离子浓度确认特别是用于万古霉素和达托霉素MIC测定时这些参数对结果影响很大。接种液制备MIC法的标准接种浓度为5×10⁵ CFU/mL。制备方法从MHA平板挑取3-5个新鲜菌落悬浮于CAMHB中调整浊度至0.5号麦氏标准约1×10⁸ CFU/mL1:100稀释得到约1×10⁶ CFu/mL的工作菌液加入含药物的96孔微量板中等体积混合最终接种浓度约5×10⁵ CFU/mL微量稀释板操作标准96孔板中每孔最终体积为100μL50μL药物 50μL菌液。药物浓度按2倍梯度稀释。接种后35°C培养16-20小时以肉眼观察最低完全抑制生长的孔为MIC值。笔者特别注意读板时要在良好光源下观察有时微弱生长不易肉眼判断可借助微量板读数仪辅助判读。在各标准中的应用CLSI M100中的应用ATCC 29213是CLSI M100文件中金黄色葡萄球菌MIC法的指定质控菌株。以下为部分药物的质控MIC范围| 抗生素 | MIC范围 (μg/mL) ||--------|----------------|| 青霉素 | 0.25-2 (耐药) || 苯唑西林 | 0.5-2 || 万古霉素 | 0.5-2 || 达托霉素 | 0.25-1 || 利奈唑胺 | 1-4 || 红霉素 | 0.5-4 || 克林霉素 | 0.06-0.5 || 庆大霉素 | 0.5-4 || 利福平 | 0.008-0.06 || 头孢西丁 | 1-4 || 阿莫西林/克拉维酸 | 0.12/0.06-1/0.5 || 氨苄西林/舒巴坦 | 2/1-8/4 |β-内酰胺酶检测质控由于ATCC 29213产β-内酰胺酶它同时也被用作β-内酰胺酶检测试验如头孢硝噻吩试验的阳性对照菌株。CLSI M100建议对金黄色葡萄球菌在报告青霉素敏感之前应进行β-内酰胺酶检测而ATCC 29213正是验证该检测系统可靠性的标准菌株。美国药典与欧洲药典USP 1117和EP 5.1.6中涉及抗菌药物效力评价时ATCC 29213可作为MIC法参考菌株。在中国药典2020版四部通则中虽未直接引用ATCC 29213但药敏方法学验证通常参照CLSI或EUCAST标准执行。行业质控用途MIC法室内质控临床实验室每日进行患者标本MIC测定时同步接种ATCC 29213进行质控MIC值应在CLSI允许范围内。自动化药敏系统验证Vitek 2、Phoenix、MicroScan等自动化药敏系统在装机或更换试剂批号时须用ATCC 29213进行系统验证。新药研发中的体外药敏评价制药企业在评估新抗菌药物对金黄色葡萄球菌的体外活性时ATCC 29213是标准的参考菌株之一。β-内酰胺酶抑制剂复合药物质控由于该菌株产β-内酰胺酶在验证阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦等复合药物时ATCC 29213的MIC值可直观反映抑制剂的保护效果。菌种保藏与管理冻干菌种在2-8°C保存有效期参照ATCC标注。复苏后在MHA平板上传代确认活力然后制备工作菌种保存于MHA斜面2-8°C4周或冻存于-80°C含15-20%甘油的冻存管中。传代次数严格控制在5代以内。由于β-内酰胺酶基因可能在高传代过程中丢失或表达量降低笔者建议对每批新制备的工作菌种做一次头孢硝噻吩试验确认产酶状态。安全注意事项ATCC 29213为BSL-2级别。操作规范与ATCC 25923一致在II级生物安全柜内操作穿戴防护服和手套废弃物经高压灭菌处理。MIC试验中使用的96孔微量板含有活菌读板后须整体浸泡于含有效氯消毒剂中或高压灭菌后再丢弃。常见问题与工程师建议Q1ATCC 29213和ATCC 25923在质控中如何选择如果实验室同时开展K-B法和MIC法K-B法用ATCC 25923质控MIC法用ATCC 29213质控。两者的CLSI质控范围不同不可混用。如果只做MIC法用29213即可它覆盖了β-内酰胺酶阳性菌株的质控需求。Q2万古霉素MIC结果不稳定如何排查万古霉素MIC受多种因素影响CAMHB中的Ca²⁺浓度、接种量精确度、培养时间和读板标准。建议每次试验同时接种ATCC 29212粪肠球菌作为万古霉素MIC的附加质控——该菌株对万古霉素的CLSI质控MIC范围更窄0.25-2 μg/mL对系统偏差更敏感。Q3MIC法与纸片法结果不一致怎么办首先确认两种方法使用的是否是同一批次培养基和同一代次菌株。如果质控均在控但患者标本结果不一致这在临床上并不罕见因为两种方法的检测原理不同。此时应以MIC法结果为准更精确并在报告中注明方法差异。关于杭州康氧医疗器械有限公司杭州康氧医疗器械有限公司专注于微生物标准菌株、ATCC菌株及相关质控产品的供应与技术服务致力于为制药企业、食品检测机构和科研院所提供可靠的微生物质控解决方案。如需了解ATCC标准菌株产品信息或技术支持详情咨询官网kystrains。免责声明本文所述菌株信息及技术参数均来源于ATCC官网、CLSI M100标准、美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、《中国药典》2020年版、ISO国际标准及《消毒技术规范》等公开权威资料仅供专业技术参考。具体实验操作请以产品随附的质检报告(COA)和说明书为准并严格遵守所在机构的生物安全管理制度。本文不构成任何产品推荐或使用建议。关键词标签:ATCC 29213, 金黄色葡萄球菌, MIC法, 肉汤稀释法, β-内酰胺酶, 药敏质控, CLSI M100, CAMHB, 最低抑菌浓度