摘要本文为卡梅德生物技术快报专题内容Fab 抗体制备是抗体工程的核心研究方向噬菌体抗体库技术是 Fab 抗体制备的重要技术平台。针对该技术在应用中存在的目的基因重组丢失、筛选交叉反应等问题本研究以 pComb3 和 pComb3X 为展示载体构建人 - 鼠杂合 Fab 噬菌体抗体库从载体适配性、培养条件、酶切鉴定等方面进行技术优化形成一套高效的 Fab 抗体制备方案为相关生物科研工作提供技术参考。关键词Fab 抗体制备噬菌体抗体库载体构建基因扩增技术优化Fab 抗体制备的核心难点在于噬菌体抗体库的构建质量其直接决定了后续抗体筛选与鉴定的效率。本研究围绕 Fab 抗体制备的全流程开展人 - 鼠杂合 Fab 噬菌体抗体库的构建与优化实验现将核心技术要点与实验结果整理如下作为卡梅德生物技术快报的重要内容分享。Fab 抗体制备的第一步为目的基因的扩增该环节是构建噬菌体抗体库的基础。实验选取外周血单个核细胞采用淋巴细胞分离液进行细胞纯离提取细胞总 RNA利用 Invitrogen 反转录试剂盒将总 RNA 反转录为第一链 cDNA根据人抗体 Fd 片段的基因序列设计 5′和 3′端特异性引物两两配对建立 PCR 反应体系通过优化引物浓度、退火温度等参数扩增获得全套人抗体 Fd 片段基因确保目的基因的完整性和纯度为 Fab 抗体制备提供优质的基因模板。Fab 抗体制备的抗体库构建阶段分别以 pComb3 和 pComb3X 为展示载体开展实验。pComb3 库构建将 Xho I/Spe I 双酶切后的 pComb3/cFab-gⅢ 载体与 Fd 片段 PCR 产物混合4℃过夜连接糖原沉淀后电转 40μl XLI-Blue 感受态菌涂 SOB-GAT 平板过夜培养刮菌后甘油保存pComb3X 库构建将 pComb3/cFab-gⅢ 载体经 Sac I/Xba I 双酶切得到嵌合轻链片段克隆入 pComb3X 后按相同方法构建抗体库。经鉴定两种载体构建的抗体库容量均达 10^7目的片段插入重组率分别为 80%、90%。在 Fab 抗体制备的抗体库扩增与鉴定环节将保存的细菌抗体库提质粒后电转化感受态细胞分别在 30℃和 37℃涂板培养经 M13K07 辅助噬菌体挽救后制备噬菌体抗体库。选取单克隆培养后提质粒采用 Nco I、Not I 单酶切和 Xho I/Spe I 双酶切进行鉴定结果显示pComb3 在 37℃扩增时目的片段重组丢失显著30℃仅轻微抑制pComb3X 在两种温度下均无明显丢失。由此确定pComb3X 为 Fab 抗体制备的优选载体30℃为 pComb3 载体的适配培养温度。本次研究形成的 Fab 抗体制备优化方案有效解决了噬菌体抗体库构建中的基因重组丢失问题pComb3X 载体的应用结合培养条件的优化大幅提升了抗体库的稳定性和质量为 Fab 抗体制备的后续抗体筛选、鉴定工作奠定了技术基础相关研究成果也为生物科研领域的 Fab 抗体制备工作提供了可复制的技术经验。